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第二节 溶液配方
一、PBS
1、无钙镁PBS
50X （Less NaCl）
1000ml 双蒸水
10g KCl
60g KH2PO4
60g Na2HPO4（Na2PO4。12H2O 151g）
溶后分装20ml管，…20 保存
20ml PBS base 50X
8g NaCl
0。3ml 0。5％酚红
980ml 双蒸水 15P 11分钟
2、NaCl 8。0g
KCl 0。2g
CaCl2 0。1g
MgCl2 0。1g
Na2HPO4 1。15g（Na2HPO4。12H2O ； 2。92g）
KH2PO4 0。2g
双蒸水至100ml； 过滤除菌，50保存。
3、 分别配制A、B、C原液
A液： NaCl 80。0g
KCl 2。0g
KH2PO4 2。0g
Na2HPO4。2H2O 14。4g（Na2HPO4。12H2O 29。0g）
双蒸水至800ml
B液：CaCL2 0。5g
双蒸水 500ml
C液：MgCl2 0。5g
双蒸水 500ml
以上三液分别 10P10’高压蒸气灭菌，冷却后
A 80V
B 100V
C 100V
H2O 720V
无菌混合
注意：
各化学药品的结晶水重量是否扣除！
二Hank’s Solution
分别配制 A、B原液
A液：NaCL 160。0
KCl 8。0 加入800ml双蒸水
MgSO4。7H2O
MgCl2。6H2O 2。0
CaCl2 2。8（溶于10ml双蒸水）
双蒸水加至 1000ml
B液：Na2HPO4。12H2O 3。04g
KH2PO4。2H2O 1。2g 800ml双蒸水
Glucose 20。0g
0。4％酚红液100ml
双蒸水至1000ml，2ml氯仿防腐，4保存。
A 1V 10P 10min 灭菌
B 1V 10P 10min 灭菌
双蒸水 18V 10P 10min 灭菌
1…4保存，可用１个月。
用5。6％NaHCO3（10P 10min 灭菌）或3。5％，调PH至7。2—7。6（加NaHCO3后须立即使用）。
三、0。4％酚红液。
称酚红0。4g→置乳钵滴加0。1N NaOH（总量11。2g/ml）并不断研磨→所有颗粒全部溶解→100ml量瓶，将已溶后的吸入，用双蒸水洗钵数次，倒入→加双蒸水至100ml摇匀，4℃保存。
四、 Versene液
乙二胺四乙酸二钠（Versene） 0。2克
NaCL 8。0克
KCL 0。2克
NaH2PO4 1。15克（NaH2PO412H2O=2。9）
KH2PO4 0。2克
双蒸水至1000ml；10P’；10’灭菌；4℃保存；可用3个月。
五、 胰酶液Tryptase
一般配成0。25％
取0。25克溶于100mlHank’s滤过除菌；分装小瓶。…20℃保存。用前融化加入青链霉素100单位/ml并用5。6％NaHCO3滴定至PH7。4…7。6
注意：
1． 为避免消化细胞成团，可配无钙胰酶液．
2． 胰酶威无臭无味的白色粉末，应密封保存，阴暗处防潮解，可分装小瓶保存．
3． 胰酶液的浓度随其活力和消化细胞的来源和种类而定．一般消化配组织用0。1％。
六。碳酸氢钠液
取NaHCO35。6克溶于100ml双蒸水中；使完全溶解后；经滤纸过滤后；分装于瓶中（5ml或2ml）10P；10’灭菌。塞紧胶塞；贴上标签；注明批号日期；4度保存备用。（在4度应为透明液；不得有沉淀）。每瓶开启后使用不得超过2次。
七。0。5％乳蛋白水解叶（LAH）
取5克乳蛋白水解物溶于100mlHank’s液中；根据需要分装50…100ml瓶；立即10P；20’灭菌；4度保存备用；用前；用5。6％ NaHCO3滴定PH7。4…7。5。
注：乳蛋白水解物极易潮解；平时必须将瓶塞紧；最好储存于干燥器中；乳蛋白水解物含有丰富的营养成分。0。5％乳蛋白水解物溶液加入适量抗生素和血清；即可用于一般的细胞培养。
（一）。CEF培养
0。5％LAH
CS 5％
Pen 100unit
Str 100ug/ml
5。6％ NaHCO3调PH至7。2…7。4
（二）PK细胞培养
0。5％LAH 89。5％
CS 10％
Pen/Str 100unit/100ug/ml
八。Earle’s液
甲液：NaCL 68g
KCL 4g
NaH2PO4 1。4g
葡萄糖 10g
双蒸水至500ml；溶解后加氯仿1ml防腐
乙液：CaCL2 2。0g
MgCL2 1。7g
0。4％酚红50ml
双蒸水加至500ml；0…4度保存备用；按比例配成Earle’s液。
甲 1V 10P 10’灭菌
乙 1V 10P 10’灭菌
双蒸水 10V 10P 10’灭菌
4度保存备用；用前用5。6％ NaHCO3调PH至7。4…7。5
九。抗菌素溶液（Pen/Str）
用灭菌双蒸水配制每毫升含
Pen（青霉素）10；000units
Str（链霉素）10；000ug
分装小瓶；…20度保存。一般培养液加这种Pen/Str％；最终浓度为100unit/ml。
十、199—F10生长液
199 5。49g（4。95g）
F10 4。9g
NaHCO3 1。7g
S。P 1ml（10万U/ml）
BFS 40ml
DDW 至1000 ml
过滤后分装备用。
199…F10维持液：BFS仅用10ml；余者同上
第三节 配制溶液的注意事项
1使用化学药品为A。R。级；标签清楚；最好组织培养专用；防止使用和保存过程中的混淆和污染。
2。配制溶液的用具；需经严格洗刷和消毒；其配制过程尽量在无菌操作下进行。
3。称量药品应力求精确。配制溶液应有详细记录以及消毒，保存；分装和使用情况。
4。配制的每批溶液；需经试用后；方可大量使用。因此需提前配制溶液。溶液保存有一定期限；保存时应经常检查；发现可疑现象和过期；不得使用。
5。注意节约；计划用多少就配多少。
第二章 淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制
第一节 融合程序
融合方法：
1、 将108 脾细胞与2—5x107 SP2/0细胞混合于1支50ml融合管中，加入30mlDMEM基础液；
2、 1000r/m离心5分钟；
3、 吸净全部培养液；
4、 在手掌上轻击离心管底部以打碎细胞积块，置400C水浴中预热；
5、 用1ml吸管在45秒内加预热至370C的50％PEG（PH8。0）1ml，边加边搅；
6、 用1ml吸管在90秒内加20—30ml
7、20—37℃静置10分钟；
7、 1000r/m5分钟；
8、 弃尽上清，轻击离心管底以分散细胞积块，重新悬浮于80—100mlHAT培养基中；
9、 按比例加入107 —2X77 腹腔细胞（约2只小鼠）；
10、 分装96孔细胞培养板，每孔0。10__0。15ml；24孔板，每孔1。0__1。5ml；
11、 7。5％CO2；37℃孵箱里培养；
12、 5天后HAT培养基换出1/2培养液；
13、 7__10天后用HT培养基换出HAT；
14、 经常观察杂交瘤细胞生长情况；待长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
15、 其它详细资料请参阅刘秀梵教授编。
第二节 溶液配方
一、 基础培养液：
1、老配方 DMEM 13。37g＋1000ml双蒸水使之溶解
丙铜酸钠 0。11g
碳酸氢钠 3。6g
pen/str 20万/2
0． 22u过滤，分装，4℃保存（不超过1个月）
2、新配方 DMEM基础液：
四蒸水 980ml NaHCO3 3。7g
DME（Giboo） 13。37g S。P（100X）10ml（本实验室用1支庆大霉素）
1NHCl调试PH至7。2_7。4（本实验室用1NnaOH调至7。2_7。4）；过滤除菌；分装后4℃保存。
3、 DMEM完全培养基：
30mlDMEM基础液中加15…20ml BFS，1mlL…G（100X）即为完全培养基。
4、 HT培养基
100mlDMEM完全培养基中加入100X HT 1ml即成，或按下列配方直接配制：
四蒸水 980ml
DME（Giboo） 13。37g L。G（100X） 10ml
HT（100X） 10ml BFS（NCS） 150_200ml
NaHCO3 3。7g S。P（100X） 100ml
用1NHCl调至7。2_7。4； 过滤除菌；分装后4℃保存。
二、 100Xaminopte