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（二） 兔抗血清的制备
程序一：
1、 每只家兔上内多点注射50—200ug蛋白抗原（FCA—Ag）。
2、 1个月后，用提纯抗原静脉注射0。5mg蛋白抗原。
3、 2周后试血；效价不够；可加强免疫一次。。
4、 于最后一次免疫2周后，心脏采血致死，分离血清，分装—20℃冻存备用。
成功范例：兔抗大肠埃希氏菌粘附素血清
程序二：
1、 第一次静脉、腹腔各注射50mg/只差速离心粗提NDV抗原。
2、 第7天重复注射一次。
3、 第14天改为腹腔、肌肉注射器，剂量加倍。
4、 第21天肌肉注射100mg/只，四脚掌各10mg/只。
5、 末次注射后10天采血，分离血清。测HI滴度计算血凝抑制单位。
（三） 鸡抗NDV血清制备
第一次用Lasota株鸡胚尿囊液静脉注射1ml/只，腹腔注射4ml/只，以的每隔5天重复注射二次（内含1mlNDV强毒鸡胚尿囊液），共三次，末次注射后第10天采血，测HI滴度。
（四） 小鼠抗血清抗原的制备
程序一：可溶性抗原的免疫程序
1、 以10—100ug抗原乳化在200ulFCA中（油包水），腹水注射3—12周龄BALB/C小鼠。
2、 4—6周后，以同样剂量抗原乳化在FIA中，作1—2次追加免疫（i。p），间隔时间为2—3周。（可试血、采血）。
3、 以等量或加倍量抗原的PBS 溶液作最后一次免疫，2—4天后取脾细胞可作融合试验用。
程序二：细胞性抗原的免疫程序
1、 细胞用PBS洗3—4次以除去血清成分。
2、 以10（7）细胞/只剂量腹腔注射BALB/C小鼠。
3、 3—8周后作追加免疫力。（可重复1—2次）。
4、 最后一次免疫2—4天取脾细胞供作融合。
程序三：短程免疫程序
1、 全菌抗原5X10（6）/只腹腔注射；（或用提纯抗原40ng/只 i。p）。
2、2—3周后，腹腔注射提纯抗原40ng/只（若每间隔2—3周用全菌抗原后提纯抗原加强免疫5—6次，此乃“密集型”免疫程序）。
2、 3天的取脾细胞可供融合用。
（五） 体外免疫程序
Development of a serum—free medium for in vitre immune responses by using b—cyclodextrin
J Immunol Methods 1998：112：227—233
（六） IBDV血清生产（从略）
第十章 细菌学试验中的几个常用技术
第一节 ；菌总数估测
一、 比浊法
1、 莫法兰德浊度计的制备
按下述方法制备标准硫酸钡悬液。
（1） 制备一份1％的C。P（化学纯）硫酸溶液。
（2） 制备一份1％C。P氯化钡溶液。
（3） 制备下述10个标准悬液：
加（1％氯化钡溶液ml数）于（1％硫酸溶液ml数）
1 99
2 98
3 97
4 96
5 95
6 94
7 93
8 92
9 91
10 90
（4） 取各标准硫酸钡沉淀的悬液3ml左右，封存在一支试管内。试管必须仔细挑选，使其直径、色泽和管型的厚度都一致。
2、 目测待检样品与几号管浊度相近，并按下列关系，估计细菌浓度：
管号 细菌含量
1 3亿
2 6亿
3 9亿
4 12亿
…… ……
二、 常规平板计数法
1、 将待测均质样品制备10（…2）10（…3）10（…4）……等适度的十进制稀释液，其方法系以无菌吸管吸取10ml原稀释液，加于90。0ml稀释液中（有时可采用1。0ml＋9。0ml）混匀。注意：稀释每个滴度的吸管都要更换，操作中防止出现泡沫。
2、 用吸管以每一个稀释液内吸取1。0ml，分别加入到有适当标志的平皿（15mm X100mm）内。注意：如果稀释菌液静置的时间超过3分钟，则在吸取前，必须重新混匀。
3、 于每个平皿内各加12…15ml标准法琼脂（冷至44…46℃。琼脂在45℃水浴中保温备用）样品的每一个稀释系列做一个只加稀释剂倾注琼脂的对照平板。
4、 立即转动或在一个平面上前后倾动平皿，使样品稀释液和琼脂培养基充分混合均匀。
5、 待琼脂凝固后，翻动平板，迅速防于35℃恒温箱内培养 48h＋（…）2h。
6、 培养后，在适当范围的双列平板用菌落计数器计数菌落数，记录每一个稀释度的平板计数结果。
7、 在三个稀释倍数中，至少应有一个稀释倍数的两个平板其菌落数在30—300个的范围之内。根据菌落数和稀释度计数样品中的需要平板数。
8、 所有从菌落数少于30个或多于300个的双列平板计算而得的需氧平板计数数，都报告为估算数。
附：1、标准法琼脂（平板计数琼脂）
胰蛋白胨 5g
酵母浸膏 2。5g
葡萄糖 1g
DW 15g
PH7。0＋（）0。1 121℃15分钟
2Butterfield氏缓冲液
基础溶液：
磷酸二氢钾 34g
D。W。 500ml
用1N氢氧化钠将PH值调整至7。2，加蒸馏水至升。121℃高压灭菌15分钟，贮于冰箱。
稀释的定量瓶装（使用液）：
取上述基础液1。25ml；加D。W。达1000ml；分装于瓶内；每瓶99或99＋（）1ml。
121℃高压灭菌15分钟。
三、 直接显微镜检查法（Official first action method，法定试行方法）。
1、 在油镜下用显微镜测微尺测定每个视野的直径d，则视野的面积为：
Af=（）（d/2）（）。
2、 每一平方厘米涂膜的视野数应为
AF 1cm（）
——— =——————
Af Af＇cm＇（）
3、 每个涂膜含0。01ml样品；则1。0ml样品的视野数应为：
AF
FF=100X————
Af
4、 每ml样品中的菌数即为：
DMSCC（）/ml=＇FF＇X＇每个视野的平均菌数＇
（direct microscopic somatic cells count 直接显微镜菌体细胞计数）
5、 FF和检查的视野数（至少10—60个）都为已知数，故可作为一个系数，称视野工作系数（FWF）代入上式而得：
DMSCC/ml=＇FWF＇X计数的总细菌数
6、 菌液涂膜的制备：
（1） 吸0。01ml样品；置于洁净、干燥的载玻片上；
（2） 将菌液涂成1cm（）的涂膜；
（3） 将玻片放于35—40℃，至涂膜干燥；注意保持玻片的水平。
（4） 浸于二甲苯中1min，再浸于95％酒精中1min；
（5） North苯胺油亚甲蓝染色剂中染色1—20min；
7、 漂洗玻片，镜检前在空气中充分干燥。切忘用吸墨纸吸干。
附：North苯胺油—亚甲蓝染色液
苯胺油（Aniline Oil） 3ml
酒精（95％） 10ml
盐酸（浓） 1。5ml
亚甲蓝（饱和溶液） 30ml
蒸馏水；加至 1000ml
将3ml苯胺油与10ml酒精相混合；在不停在搅拌下徐徐加入1。5ml盐酸。。加30ml饱和亚甲基蓝溶液，用水稀释至100ml，过滤。
四、 分光光度计测定法
a、 波长选择420nm，550nm，600nm。
b、 下列回归方程为420nm条件下建立。
第一组
（1） 大肠杆菌
lgy（）=7。1370＋2。7878X
（2）金黄色葡萄球菌：
lgy（）=7。4722＋4。7259X
（3白色葡萄球菌：
lgy=6。9067＋2。6950X
（5） 白色念珠菌：
lgy=5。9512＋2。1948X
有效测定范围在103___106ofe/ml
（摘自俞晓峰文章）
第二组
（1） 沙门细菌（S。pullorm）
未离心肉汤：lgy=7。3461＋7。5306X
离心菌悬液：lgy=7。3112＋7。7191X
（2） 大肠杆菌：
未离心肉汤：lgy=7。4197＋1。2113X
离心菌悬液：lgy=7。3764＋5。8632X
五、最近似数（MPN）（the most probable numbers）是一个代表作用物中活菌浓度的估计数。这个数是应用机率的原理测定作用物（样品）中细菌的总浓度而推知的。请参阅有关文献。
第二节 几种常用细菌培养基的配方
一、Minca Med 1000ml（Minca—Isoritalex）
KH2PO4 1。36g
NA2HPO4。12H2O 25。3g（NA2PO4。12H2O 10。1g）
Casamino acids 1g （Difco）
Trace salts solution’ 1ml’